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硬組織病理切磨技術(shù)主要是針對骨組織、帶植入物的骨組織、埋置有堅硬植入物的其他組織標(biāo)本，或在動物試驗階段進行了親骨熒光素標(biāo)記的不能進行脫鈣的骨組織，通過脫水、浸潤、包埋處理，由硬組織切磨系統(tǒng)完成的組織病理切片制作的技術(shù)。有文獻(xiàn)報道骨組織及埋置堅硬植入物的組織進行病理組織切片制作，通常利用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)［1－3］。硬組織病理切磨技術(shù)最顯著的特點是不破壞組織中的植入物，且保持了組織與植入物之間原有的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，這對研究組織內(nèi)植入物的長入情況具有重要意義。本文結(jié)合本實驗室日常硬組織制片工作經(jīng)驗，分析硬組織病理切片制作的每個處理環(huán)節(jié)，以期能為其他技術(shù)人員提供參考。

1.1 組織標(biāo)本試驗樣品CF/PEEK 復(fù)合材料按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.6-2015 醫(yī)療器械生物學(xué)評價: 植入后局部反應(yīng)試驗的要求進行試驗［4］。動物試驗周期結(jié)束后，獲取到埋置有CF/PEEK 復(fù)合材料的肌肉組織塊合計36塊。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林(濟南百博生物公司) ，無水乙醇( 國藥集團化學(xué)公司)，蘇木精染液、伊紅染液(北京索萊寶公司) ，Technovit 7200VLC樹脂試劑盒，EXAKT 300CP硬組織切片機、EXAKT 400CS硬組織磨片機、EXAKT 402平行粘片裝置、EXAKT 510 脫水浸潤儀、EXAKT 520 光固化包埋機、EXAKT 530 干燥滲透聚合裝置( 德國EXAKT 公司) 。

1.3 方法
1.3.1 組織標(biāo)本的固定組織經(jīng)10% 中性福爾馬林固定，固定液的量一般為被固定組織標(biāo)本體積的10 倍。固定24h后，更換新的10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林進一步固定。

1.3.2 組織的切割取材將充分固定后的組織標(biāo)本經(jīng)硬組織切片機切割為5mm 厚標(biāo)本，置于10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林中繼續(xù)固定12 h后再進行后續(xù)操作。切割取材前應(yīng)詳細(xì)觀察組織標(biāo)本塊的外觀，詳細(xì)了解植入物的植入位置、植入方向、植入深度等。切割取材過程中應(yīng)防止樣品與組織脫離。切割取材后的組織標(biāo)本置于自來水中，流水沖洗至少1 h，水流應(yīng)盡可能的小操作過程應(yīng)輕柔，以防植入物與組織脫離。

1.3.3 標(biāo)本脫水將組織標(biāo)本依次置于50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100% 乙醇Ⅱ，分別脫水48h，不同濃度乙醇要現(xiàn)用現(xiàn)配。在抽真空、震蕩的條件下進行脫水會提高脫水效果。

1.3.4 標(biāo)本浸潤脫水結(jié)束后，將標(biāo)本逐級浸入不同體積比的乙醇/Technovit 7200 VLC 樹脂( 70% /30%、50% /50%、30% /70%) 混合液中進行浸潤，每一步驟處理48 h，后置于100% Technovit 7200VLC 樹脂Ⅰ缸處理14天，100% Technovit7200 VLC 樹脂Ⅱ缸處理14天。注意浸潤過程中要避光，且溫度不超過25 ℃，每隔一段時間對樣本進行監(jiān)控、檢查，避免其固化。值得注意的是，在抽負(fù)壓、真空條件下浸潤，可以使組織得到充分浸潤，且可以有效減少組織塊中殘存的氣泡。

1.3.5 光固化包埋聚合取出浸透完全的標(biāo)本，將需要觀察的組織切面向下置入塑料包埋模具中，加入Technovit 7200VLC光聚樹脂，利用EXAKT 530 干燥滲透聚合裝置抽真空，排凈組織塊內(nèi)殘存的氣泡。固化過程由低強度的黃光與高強度的藍(lán)光共同輻照完成，先黃光輻照6h，后藍(lán)光輻照8h，經(jīng)輻照光固化聚合后埋置有CF/PEEK 復(fù)合材料的肌肉組織樹脂包埋塊(圖1)。

1.3.6 平行粘片制作利用千分尺測量載玻片A的厚度，共計測量3次，取平均值，將聚合過的組織標(biāo)本包埋塊從包埋模具中取出，利用Technovit 4000 粘合劑套裝將包埋塊粘于載玻片A 上。將粘附有標(biāo)本包埋塊的載玻片A經(jīng)真空吸附于EXAKT 300CP切片機樣本頭上，通過激光定位裝置，在包埋標(biāo)本上進行定位，經(jīng)帶鋸切割暴露出需要的切面，拋光后利用千分尺測量載玻片A、黏合劑、標(biāo)本包埋塊的總厚度，共計測量3次，取平均值。另取一張載玻片B，利用千分尺測量載玻片B的厚度，共計測量3次，取平均值。在EXAKT 402載片黏合裝置上用Technovit 7210VLC精密粘合劑將載玻片B黏附于標(biāo)本塊的拋光面，如此載玻片A、樹脂包埋標(biāo)本塊、載玻片B合成一個類似三明治的結(jié)構(gòu)，測量其總厚度，共計測量3次，取平均值，進而計算出膠的厚度，以便后續(xù)進行切片。

1.3.7 切片用EXAKT 300CP 硬組織切片機將包埋有組織標(biāo)本的樹脂塊進行切割，一般將切割厚度設(shè)為200μm。值得注意的是，在切片過程中任何外力都會使切割面產(chǎn)生凹凸不平現(xiàn)象，因此切片過程中切勿施加外力干擾。切片完成后，取出切片，取下樣本塊，利用千分尺測量( 切片+ 膠+ 組織)總厚度，進而計算出實際切割下來的組織標(biāo)本厚度。

1.3.8 磨片經(jīng)EXAKT 400CS 硬組織磨片機進行磨片，先進行粗磨，再進行精磨，最后進行拋光，將組織磨至30μm厚。

1.3.9 組織切片的染色將組織切磨片經(jīng)蒸餾水充分清洗后，參照文獻(xiàn)［5］的方法進行染色:蘇木精染液30 min，自來水充分沖洗，1%鹽酸乙醇分化30s，流水沖洗后再入溫水返藍(lán)，置伊紅染液5min，自來水沖洗，待組織切片自然干燥后經(jīng)Technovit 7210VLC封片，光鏡下觀察。制得的組織切片經(jīng)HE 染色后，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)著色對比鮮明，組織細(xì)胞形態(tài)清晰，可直接在光學(xué)顯微鏡下進行組織學(xué)觀察，可見植入的CF/PEEK 復(fù)合材料與周邊肌肉組織結(jié)合緊密( 圖2、3) ，植入的復(fù)合材料周圍可見新生纖維結(jié)締組織，纖維囊壁結(jié)構(gòu)已形成。

圖3 高倍鏡下埋置有CF/PEEK 復(fù)合材料的肌肉組織病理切片：a．試驗樣品CF/PEEK復(fù)合材料; b.肌肉組織

GB/T16886.6-2015 醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)中提到對植入物的評價，要特別關(guān)注組織與材料之間的界面，且該標(biāo)準(zhǔn)推薦采用硬組織制片技術(shù)進行組織切片制作［4］。對埋置有種植體的組織標(biāo)本進行制片時，硬組織切磨技術(shù)可以直接切含有堅硬植入物的組織標(biāo)本，而普通的石蠟包埋組織切片需要先剔除組織內(nèi)埋置的植入物，這往往會使原有的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生改變，無法客觀的評價植入物與周邊組織的結(jié)合情況，影響后期的評價分析。骨組織是由大量鈣化的細(xì)胞間質(zhì)和骨組織細(xì)胞組成，為結(jié)締組織的一種，因細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)有大量鈣鹽沉積，故骨組織質(zhì)地十分堅硬，石蠟包埋組織切片必須對骨組織進行脫鈣處理［6－8］。脫鈣會使組織細(xì)胞皺縮，同時會使骨的礦化結(jié)構(gòu)遭到破壞，而硬組織切磨技術(shù)無需脫鈣處理，完整的保存了骨組織的礦化結(jié)構(gòu)，組織切片經(jīng)染色處理后，可用于研究骨修復(fù)材料植入后的骨組織形態(tài)計量學(xué)及骨整合相關(guān)的研究。雖然樹脂包埋硬組織制片也存在不足，如制片過程復(fù)雜，制片操作步驟繁瑣，盡管存在難點，但硬組織切磨技術(shù)能夠保持種植體與周邊組織界面的組織結(jié)構(gòu)，可直觀反應(yīng)結(jié)合界面的生長結(jié)合情況，是目前研究種植體-組織結(jié)合界面重要的技術(shù)方法。